Antikroppar

 

 

 

 

Ett projektarbete av

Pernilla Johansson, Lena Alm, Helena Nord och Joel Backdalen

BKE1 VT 2002

 

 

Inledning

Antikroppar, även kallade immunoglobuliner, är en del av det mycket komplexa immunförsvaret som finns hos alla ryggradsdjur. De bildas i B-lymfocyter och utsöndras till blodomlopp och lymfsystem där de binder till kroppsfrämmande ämnen, antigener, som attackeras och neutraliseras.

 

Antikroppar har formen av ett Y med två tunga och två lätta kedjor, variabla och konstanta domäner med minst två antigenbindande områden. Genom unika genetiska mekanismer kan människan bilda 1011 olika specifika antikroppar och i människokroppen genereras så många som 50 miljoner antikroppsproducerande B-celler per dag som i sin tur kan producera antikroppar med en hastighet av 2000 per sekund.

 

Vetenskapen har utvecklat en mängd olika metoder att använda antikroppar i medicinskt och forskningssyfte, exempelvis i vaccin och som katalytiska hjälpmedel.

Historik

En av de sjukdomar som plågat mänskligheten är smittkoppor. Kineserna upptäckte i början av 1000-talet att de som överlevt smittkoppor inte blev smittade en andra gång. Det blev därför accepterat att infektera unga barn med sjukdomen där man lät en infekterad person gnugga sina koppor mot ett sår på det friska barnet. De barn som överlevde blev då immuna medan de som dog ansågs bespara sina föräldrar besväret och kostnaderna för deras uppväxt, bara för att kanske mista dem senare i sjukdomen. Tekniken fick namnet variolation och spreds även till England där den blev en vanlig metod vid smittkoppsimmunologi. Det tog inte lång tid innan tekniken fanns i övriga Europa och de amerikanska kolonierna. 1774 fann Benjamin Jesty att kokoppor var en mildare variant och variolade sina barn mot smittkoppor med bra resultat. 1798 hörde Edward Jenner talas om Jestys försök och beslöt att forska vidare. Han fann att kokoppor fungerade som vaccin mot smittkoppor och hans teknik kallades vaccination som blev den mest använda metoden mot kopporna. WHO beslöt 1958 att försöka utrota sjukdomen genom massvaccination och detta var så effektivt att 1980 blev smittkoppor den första infektionssjukdomen som förklarades utrotad.

 

1890 demonstrerade Emil von Behring att vaccinationsskyddet hade samband med närvaron av faktorer i blodet som fick namnet antikroppar. Detta bevisades av den tyske kemisten Richard Pfeffer som visade att antikroppar förstörde en kolerainfektion. Inte förrän på 60-talet lyckades man på allvar studera de specialiserade vita blodkroppar som producerar immunitet i form av B- och T-lymfocyter (1).

Antikroppar

eller immunoglobuliner, utsöndras av specialiserade vita blodkroppar s.k. B-lymfocyter eller B-celler. Varje B-cell kan endast binda till en typ av antigen, B-cellen känner igen antigenet genom proteiner på dess yta - antigenreceptorer. En antigenreceptor är i princip ett antikroppsprotein förankrat till B-cellens membran. Lymfocyterna skiljer sig från alla andra celler i kroppen genom att de har cirka 100,000 identiska receptorer i sitt cellmembran. Alla antigenreceptorer på en B-cell är identiska, men skiljer sig mellan olika B-celler. Den generella strukturen är i stort sett lika, men skillnaden ligger i den aktiva ytan som interagerar med antigenet. Antigenreceptorn känner igen och binder till en yta på antigenet - antigendetergent eller epitop. Epitop och receptor passar ihop som två pusselbitar, vilket är nödvändigt för att aktivera B-cellen att producera antikroppar.

 

Ett antigen stimulerar produktionen av antikroppar som i sin tur binder till antigenet.

Ett antigen binder till en antikropp med olika krafter; Van der Waal´s krafter, vätebindningar, elektrostatiska interaktioner, hydrofobiska krafter och affinitet.

 

När ett antigen binder till B-cellens yta stimulerar det B-cellen att mogna och delas till en grupp identiska dotterceller - en klon. Den mogna B-cellen, kallad plasmacell, utsöndrar miljontals antikroppar till blodomloppet och lymfsystemet med en hastighet av cirka 2000 antikroppar per sekund. Alla celler från klonen blir inte antikroppsproducerande plasmaceller, några kommer att fungera som så kallade minnesceller. Dessa kan svara snabbare än den ursprungliga B-cellen på en andra invasion av samma antigen. När produktionen av antikroppar väl har börjat, fortsätter den i flera dagar tills alla antigenmolekyler är borta. Antikroppar cirkulerar sedan i systemet i flera månader för att säkra immunitet för den specifika antigenen (2).

 

B-celler Omarrangerar generna som kodar för deras antikroppsprotein, så varje cell tillverkar en unik antikropp. B-celler har på sin yta en membranbunden form av sin antikropp. Bindning från denna till ett antigen triggar en process som så småningom aktiverar B-cellen att syntetisera och utsöndra många kopior av antikroppen. Varje antikroppsmolekyl är i allt väsentligt identisk med antigenreceptorn på B-cellen som producerade den. På detta sätt kan en liten mängd antigen framkalla en förstärkt och specifik immunrespons som rensar kroppen från källan till antigenet (3).

 

När antikroppar cirkulerar kan de attackera och neutralisera antigener som är identiska till de som utlöste immunresponsen. Antikroppar attackerar antigener genom att binda till dem. Bindningen av en antikropp till exempelvis ett toxin kan neutralisera giftet genom att helt enkelt ändra dess kemiska sammansättning. Sådana antikroppar kallas antitoxiner. Genom att fästa till invaderande mikrober kan andra antikroppar göra dessa mikroorganismer orörliga eller förhindra dem att penetrera kroppsceller. I andra fall kan en antigen täckt av antikroppar falla offer för en kemisk kedjereaktion i komplement med en serie andra proteiner i blodet. Denna reaktion kan antingen medföra att antigenen spricker eller locka till sig celler som äter upp den (fagocytos) (2).

Antikroppars struktur

En antikropp i serum är en mix av ungefär 100 miljoner något olika typer av molekyler. En typisk antikroppsmolekyl (IgG center) har 12 domäner, arrangerade i två tunga och två lätta (H och L) kedjor som är sammansatta med cystein aminosyror. Dessa bildar en disulfidbrygga så att domänerna ligger tillsammans i par och hela molekylen har formen av ett flexibelt Y (figur 1). I varje kedja är N-terminaldomänen den mest variabla, resten är ganska konstant. I den variabla regionen är den maximala variationen av aminosyrasekvensen den man ser i de sex hypervariabla regionerna (tre per kedja) som tillsammans bildar ett b-flak som är den antigen-bindande ytan. (4).

 

 

 

Figur 1. Schematisk bild av antikroppens tunga och lätta kedjor.

 

 

 

En antikropp har minst två identiska antigenbindande områden, men vissa antikroppar kan bestå av två eller fem identiska Y-enheter och har då fyra resp. tio antigenbindande ytor. Hos människan finns nio former av tunga och två former av lätta kedjor. De tunga kedjorna kallas A, D, E, G och M, det finns fyra G- och två A-varianter. Utifrån den tunga kedjans uppbyggnad, där de olika varianterna representerar olika funktioner, delas antikroppar in i fem klasser.(6); IgG, IgA, IgM, IgD och IgE (figur 2). Dom skiljer sig i storlek, laddning, aminosyra komposition och kolhydrat innehåll (5).

 

Immunoglobulin klass A, IgA, uppträder hos människan i två former, IgA1 och IgA2. IgA1 dominerar i serum, medan IgA2 dominerar på slemhinnorna. IgA förekommer dels som antikropp i serum, dels som sekretorisk IgA i sekret som saliv, tårar och tarmsekret. Sekretoriskt IgA består av två IgA-molekyler som hålls samman av två särskilda proteinkomponenter. Det sekretoriska IgA är mycket motståndskraftigt mot nedbrytning. IgA är den antikroppsklass som produceras i störst mängd hos människan och då framförallt i mag-tarmkanalens lymfatiska system. Sekretoriskt IgA finns även i hög koncentration modersmjölk och bidrar därigenom till skydd mot infektioner, främst i tarmen, hos det diande barnet.

 

Immunoglobulin klass D, IgD, är en antikroppstyp vars exakta funktion ännu är oklar. Den utgör mindre är en procent av blodplasmans olika sorters antikroppar. Den finns i låg koncentration i serum hos människan. IgD sitter förankrat på ytan av de flesta mogna B-lymfocyter. Det är troligt att IgD-molekylerna på cellytan fungerar som mottagare, receptorer, för främmande ämnen, antigener.

 

Immunoglobulin klass E, IgE, finns hos människan i ytterst låg koncentration i serum. Trots detta kan IgE-molekylerna framkalla kraftiga inflammatoriska och allergiska reaktioner då en IgE-antikropp möter sitt motsvarande antigen. IgE-antikropparnas normala funktion är sannolikt att ge visst skydd mot parasitinfektioner.

 

Immunoglobulin klass G, IgG, förekommer hos människan i fyra olika former (subklasser): IgG1, IgG2, IgG3 och IgG4. Dessa är ganska lika, men skiljer sig åt i viktiga egenskaper, t.ex. förmåga att överföras från moder till foster och livslängd i serum. De viktigaste biologiska funktionerna hos IgG är förmågan att binda komplement, att passera över moderkakan till foster och att binda till bestämda strukturer på olika cellytor.

 

Immunoglobulin klass M, IgM, är den antikroppstyp som produceras först i livet och som också kommer tidigast vid en immunreaktion, t.ex. vid en infektion. IgM-molekylen är störst bland antikroppsmolekylerna. Den består av fem enheter som via att annat protein sitter ihop i en ring. P.g.a. sin storlek är IgM-antikroppen speciellt effektiv vad gäller aktivering av komplementsystemet (6).

 

 

 

Figur 2. Antikropparnas fem klasser; IgG, IgA, IgM, IgE och IgD.

 

 

 

IgG molekylen har en typisk antikropps struktur. Den har två disulfidbindningar i den lätta kedjan, en i den variabla regionen och en i den konstanta regionen. Det finns fyra sådana bindningar i den tunga kedjan som dubbelt så lång som den lätta. Varje disulfidbindning omgärdar en peptid loop på 60-70 aminosyror (5).

Biosyntes av immunoglobuliner

Immunsystemet har en anmärkningsvärd mångfald, med möjligheter till så många som 1011 antikroppar med olika specificitet. Storleken av immunförsvarets "repertoar" gör det omöjligt för varje enskild antikropp att koda för sin egen DNA-sekvens. Istället generar olika unika genetiska mekanismer olikheterna i de variabla regionerna av antikropparna.

 

Enkelt uttryckt är arvslinjen för antikroppar lokaliserade i tre olika loci på den 22:a humana kromosomen. Varje immunoglobulin-gen-loci innehåller gensekvenser (exoner) som kodar för V (variabla) och C (konstanta) domäner. Den arvslinje som kodar för V-regionerna är dessutom delad i två eller tre grupper av gensekvenser, varje grupp innehållande allt mellan fyra till hundratals gensekvenser. Gensekvenser från varje grupp är sedan omgrupperade och hopsatta för att forma det DNA som kodar för den variabla regionen. Detta DNA är i sin tur omarrangerat så det placeras intill exonerna för de konstanta regionerna, bildande immunoglobulingenen (det DNA som kodar för en given kedja i en bestämd antikropp). Omarrangemang för endast en produktiv H- och L-kedjegen sker i varje B-cell, vilket säkrar att varje cell producerar antikroppar av endast en specifik typ (7).

 

Den mänskliga kroppen genererar så många som 50 miljoner nya antikroppsproducerande B-celler varje dag. Den stora majoriteten av dessa celler producerar en antikroppsmolekyl som är unik för den cellen och dess avkommor. Den genetiska informationen för denna mångfald finns i mer än 1000 små DNA-sekvenser. Gensekvenserna som kodar för de variabla och konstanta regionerna av antikroppar är samlade i tre genpooler; en för den tunga kedjan och en för var och en av de två isotoperna av lätta kedjor, på separata kromosomer. I genpoolen för den tunga kedjan kodas den variabla domänen av tre typer av segment; V, D och J. V kodar för uppskattningsvis de första 90 aminosyrorna, D för den hypervariabla regionen och J för de resterande 15 aminosyrorna på den variabla domänen.

 

Det finns ungefär 1000 olika V-segment, 10 D-segment av varierande längd och 4 olika J-segment i genpoolen för den tunga kedjan. DNA för den variabla domänen för en ny B-cell är slumpmässigt sammansatt med någon av vardera av dessa segment till en enhetlig exon, en process som kallas combinatorial joining och som kan kombineras på cirka 40,000 olika sätt. Kopplingen av dessa segment kan också innebära att extra nukleotider adderas under processen, vilket ger ändå fler möjligheter. V-D-J-exonen kopplas till en av de åtta C-segmenten som kodar för de konstanta regionerna av de olika klasserna av tunga kedjor. Den genetiska mekanismen som ligger till grund för den lätta kedjan är liknande, förutom att det inte finns några D-segment och mångfalden beror därför till stor del på de olika möjligheterna till V-J-kopplingar.

 

Genom dessa genetiska mekanismer uppskattas det att åtminstone 90,000 olika tunga och 3000 lätta kedjor kan uppstå. Nästan alla tunga och lätta kedjor kan kopplas samman till en fungerande antikropp, vilket ger B-cellen 3000 x 90,000 = 270 miljoner olika antikroppsmolekyler att välja mellan. Genom punktmutationer i B-cellernas exoner för de olika domänerna stiger dock denna siffra mångdubbelt (3).

 

Reagin

även kallade homocytotropiska antikroppar eller prausnitz-küstner antikroppar, är en typ av antikroppar som hittas i serum och hud från allergiskt överkänsliga personer och i mindre mängder hos normalkänsliga personer. Största delen reaginantikroppar är IgE-fraktioner i blodet. Reaginer förstörs lätt genom upphettning, passerar inte genom placentabarriären till foster och har mycket längre livslängd än andra typer av antikroppar (2).

Haptener

Haptener är små molekyler som stimulerar produktionen av antikroppar när de är kopplade till en större molekyl - en bärarmolekyl. Haptener bildar starka kovalenta bindningar till en bärarmolekyl, oftast ett protein. Hapten-bärarkomplexet stimulerar produktionen av antikroppar, och blir immunogener (med förmåga att väcka en antikroppsreaktion). Haptenen reagerar specifikt med den antikropp som producerats mot den för att framkalla en immun- eller allergisk reaktion. Fast haptenen inte ensam kan framkalla en antikroppsrespons kan den binda till antikroppar och agera som ett antigen.

 

Många läkemedel som kan orsaka allergiska reaktioner, t ex penicillin, fungerar som haptener. När läkemedlet kommer in i kroppen reagerar det kemiskt med proteiner i kroppen och bildar ett hapten-bärarkomplex som kan leda till ett livshotande tillstånd. Forskare har använt haptener för att konstruera syntetiska vaccin mot olika infektionsorganismer (2).

Monoklonala antikroppar

Monoklonala antikroppar har en förmåga att binda specifikt till vissa antigenmolekyler, vilket har gjort dem intressanta inom medicinsk och biologisk forskning. Metoden innebär att enstaka lymfocyter som producerar en speciell sorts antikropp kan odödliggöras. Denna klon producerar antikroppar som bara känner igen en och samma epitop. Man kan ta fram flera olika kloner av antikroppsproducerande celler mot ett antigen där varje klon producerar antikroppar med sin egen unika specificitet. Ett protein kan således ha många epitoper och därför ge upphov till ett så kallat polyklonalt antikroppssvar (8).

 

Metoden kallas hybridomateknik. Hybridomas är hybridceller gjorda genom sammanslagning av en cancerogen plasmacell och en normal antikroppsproducerande plasmacell tagen från ett djur som blivit immun mot ett visst antigen. Hybridomacellen kan producera ett stort antal identiska antikroppar (monoklonala antikroppar) (2). Både polyklonala och monoklonala antikroppar används i terapeutiskt syfte, så kallad passiv immuterapi. En begränsning med monoklonala antikroppar är att antikroppen förutom att den är monoklonal i sin epitop-igenkänning också är begränsad vad gäller sin biologiska effekt, till den klass monoklonalen tillhör. Monoklonala antikroppar måste också produceras genom cellodling med de biologiska risker detta kan (8).

Katalytiska antikroppar

Molekylärbiologi har gjord det möjligt att framställa monoklonala antikroppar i stora kvantiteter, och därmed förhöja deras lämplighet som diagnostiskt och terapeutiska verktyg inom biologi och medicin. Enligt en ny upptäckt kan monoklonala antikroppar utföra katalytiska reaktioner. Genom att använda transition state-analoger för vissa speciella kemiska reaktioner kan antikroppar produceras som binder dessa analoger med hög affinitet. Antikroppen kan då binda substratet i den kemiska reaktionen och en del av bindningsenergin kan användas till en konformationsändring av substratet till transition state. Det har visat sig att antikroppar kan katalysera en lång rad olika organiska reaktioner, även ester- och amidhydrolyser (9).

 

Pauling fastslog 1948 att enzym är strukturella komplement till transition state för en reaktion och fungerar genom att binda och stabilisera transition state. (Transition state är en högenergisk struktur som kan anses vare en intermediär mellan substratet och produkten). Följaktligen så ökar det koncentrationen av molekyler i transition state och därmed accelererar reaktionshastigheten. Pauling föreslog att antikroppar saknar katalytisk funktion pga. att de binder grundtillståndet som har låg energi och enzymer binder högenergetiskt transition state. Antikroppar som är producerade under immunolog respons saknar generellt katalytisk aktivitet pga. att deras ligander är dominerande i grundtillståndet. Enzymer och antikroppar delar flera gemensamma egenskaper. Båda binder sina ligander specifikt, selektivt, reversibelt och med hög affinitet.

 

Konceptet katalytiska antikroppar grundades av Jencks 1969. Hans hypotes var att antikroppar som selektivt binder till reaktioners transition states borde vara katalytiska. Alltså borde antikroppar från djur immuniserad med transition state analog åstadkomma katalys. Trots att katalys av antikroppar teoretiskt var känt, visade sig sökandet efter katalytiska antikroppar i polyklonala sera vara högst frustrerande, och den riktiga identifikationen av antikroppar med signifikant katalytisk funktion fick avvakta på utvecklingen av hybridomateknologin. Produktionen av monoklonala antikroppar har gjort det möjligt för katalytiska antikroppar att identifieras och har underlättat analyser av dess kinetik, struktur och mekanism.

 

Den första katalytiska antikroppen togs fram av P. G. Schultz och R. A. Lerner 1986. Dessa antikroppar var specifika för transition state-analoger och accelererade hydrolysen av dess substrat med en ungefärlig faktor på 1000. Sen dess har katalytiska antikroppar som ökar reaktionshastigheter höjts till att ha hastigheter som närmar sig de hastigheter man kan se hos enzymer. Substratspecificitet, stereospecificitet och kompetativ inhibering är karaktärer hos enzymkatalyserade reaktioner som också delas av antikroppskatalyserade reaktioner. Det är inte troligt att den molekylära strukturen hos antikroppar kommer att kunna imitera egenskaperna hos allosteriska enzymer. Eftersom vissa katalytiska antikroppar har en blygsam reaktionshastighet jämfört med enzymer, måste stor noggrannhet användas vid preparationen av antikroppar så de är fria från kontaminering av enzymer. Detta är väldigt viktigt då kända enzymer katalyserar samma reaktion som antikroppar.

 

De enda katalytiska antikropparna som är identifierande är lgG och lgA. Övriga är testade men saknar katalytisk förmåga och flera olika strategier finns för att ta fram katalytiska antikroppar (7).

 

 


Källförteckning

1. Tizard Ian R, Principles of Immunology, 3:e utgåvan, Saunders College Publishing

1992

2. Britannica Online, http://www.search.eb.com/eb/, 2002-05-27

3. Branden, C. and Tooze, J., Introduction to Protein Structure, Garland
Publishing, Inc. New York & London, 1998
4. Playfair J H L, Immunology at a Glance, 6:e utgåvan, Blackwell science Ltd,1996

5. Roitt m fl., Immunology, 6:e utgåvan, Harcourt Publishers Ltd,2001

6. National Encyklopedien Online

7. Mayforth Ruth D, Designing Antibodies, Academic Press, Inc. San Diego 1993

8. Projekt - antikroppar, http://www.tripep.se/underrrubriker-projekt/antikroppar.html

9. Wiley Europe, Catalytic Antibodies, http://www.wileyeurope.com/cda/product/