Bloddoping med EPO och Hemohes
                                            Av: Anders Hellström, Maria Karlsson och Jimmy Larsson

                                                                             
                                                                             Bild 1. EPO
 

Introduktion och historia

Den senaste tiden har bloddoping uppmärksammats i media framförallt efter att det finska skidlandslaget fällts för att ha använt det otillåtna hormonet Erytropoetin (EPO) för att höja prestationsnivån. För att försöka dölja EPO som ger ett högre blodkroppsvärde tog finländarna Hemohes för att öka andelen plasma i blodbanan och spädde på så vis ut blodkropparna så att detektering av ett högt blodvärde gjordes svårare. Vårt mål med den här uppsatsen är att redogöra för hur EPO fungerar, hur det kan döljas, detekteras och vad det finns för biverkningar.
EPO (Erytropoetin) är ett glykopeptidhormon som tillverkas i njurarna hos vuxna individer och stimulerar tillväxten och mognaden av Erytrocyter (röda blodkroppar). Detta innebär att när syrekoncentrationerna i blodet sjunker vid t.ex. bergsbestigning tillverkar njurarna EPO, vilket binder till receptorer i benmärgen som styr tillverkningen av röda blodkroppar. När nivåerna av röda blodkroppar når den nivån att den klarar av att syresätta kroppen så slutar njurarna att tillverka EPO.
En bra beskrivning av EPOs funktion ger David Okrongly, vice president för hematology vid Bayer Diagnostics "Youâre basically putting your red-blood-cell production into turbo mode," (http://www.cannabisnews.com/news/thread7002.shtml)

Historia om EPO


Röda blodkroppar (Erytrocyter)

Röda blodkroppar har till uppgift att transportera hemoglobin, som är en syrebärare, mellan lunga och vävnad. Eftersom röda blodkroppar inte har någon cellkärna så kan de inte genomgå vanlig celldelning och detta gör att de måste nytillverkas. Produktionen av röda blodkroppar hos vuxna människor sker i benmärgen. Där bildar stamceller (Pluripotent hematopoietic stem cell) under stimulering av t ex EPO proerythroblaster som i sin tur delar sig ett antal gånger. Vid varje delning sker en ökning av hemoglobin till den slutliga nivån på ca 34% i den mogna blodkroppen.

Mängden röda blodkroppar som finns tillgängliga i kroppen regleras noggrant, så det alltid finns tillräckligt med blodkroppar för att förse kroppen med syre. Vid otillräcklig syreförsörjning börjar genast benmärgen producera röda blodkroppar som vid t ex hög höjd eller sjukdom. EPO (erytropoetin) stimulerar tillverkningen av röda blodkroppar.
 
 

Erytropoetin (EPO)

EPO är ett hormon som sagt reglerar produktionen av röda blodkroppar. Det syntetiseras främst i njurarna hos vuxna individer, men även till viss del i levern och vissa studier visar att en liten mängd EPO även produceras av makrofagerna i benmärgen. Det är dock inte känt var i njurarna som tillverkningen sker.

När tillgången till syre i blodet sjunker p g a anemi (blodbrist), lågt Hb eller dåligt blodflöde etc. aktiveras syntesen av EPO i njurarna och mängder av hormonet kommer ut i blodflödet. Detta stimulerar produktionen av röda blodkroppar (erytrocyter) i benmärgen tills syresättningen av vävnaderna återgår till sin normala nivå m h a feed back kontroll. Se fig 1.
 
 

Figur 1. Den EPO kontrollerande stimuleringen av tillverkningen av röda blodkroppar. Ökad tillgång på syre i vävnaden ger upphov till en minskning av EPO produktion.
 

EPO används som dopningmedel då några av dess funktioner är att höja syrelagringsförmågan och syretransporten i kroppen. Detta leder till ökad prestations förmåga i uthållighetssporter där den aeroba förbränningen är av störst betydelse som t ex cykling, skidåkning och långdistanslöpning.

Resultaten av denna typ av doping är påtaglig då den kan ge en prestationsökning på upp till 10%. En bieffekt är att blodtrycket höjs. För att uppnå samma effekt som vid EPO dopning tränar många idrottare på hög höjd eller i så kallade hög höjds hus där den låga syrekoncentrationen ger en ökad produktion av blodkroppar.

Om ett djur eller en människa placeras i en syrefattig miljö så börjar EPO att tillverkas inom minuter eller timmar och når sin maximala tillverkning vid ca 24 timmar. Det tar dock upp till 5 dagar innan man kan detektera höjda blodkroppsvärden. Detta är för att EPO stimulerar tillverkning av proerythroblaster från stamcellerna men även att de passerar snabbare genom de olika mognads stadierna. EPO är en väldigt kraftig kontroll mekanism för tillverkning av röda blodkroppar.
 

Struktur

Mänskligt EPO är ett glykoprotein som består av 165 aminosyror med två disulfidbindningar (mellan Cys7-Cys161 och mellan Cys29-Cys33) och fyra poly-sackaridkedjor (tre kvävelänkade vid Asn 24, Asn 38 och Asn 83 och en syrelänkad vid Ser 126). EPO har 166 aminosyror från början men en arginin vid C-terminalen klipps bort direkt efter bildandet. Molekylvikten (inklusive kolhydrater) är totalt ca 30-34 kDa men själva polypeptidkedjan har en molekylvikt på endast ca 18 kDa.


Bild 1. EPO

Kolhydraterna är nödvändiga för den biologiska aktiviteten hos EPO men nya studier visar att främst N-länkade kolhydrater är viktiga för dess funktion. Detta beror på att N-länkade kolhydrater har "sialic syror" längst ut vilket de O-länkade kolhydraterna inte har. Sialic syrorna hindrar "rapid clearance" av hepatitreceptorer som annars känner igen ytliga galaktoser och hormonet skyddas på så sätt på sin väg i blodflödet. EPO behöver dessa sialic syror för att det ska komma fram välbehållet till sin receptor. De N-länkade kolhydraterna, med sialic syror längst ut, behöver dessutom ha ett visst förgrenat mönster (branching pattern) för att uppnå högsta biologiska aktivitet. Det finns olika typer av EPO men skillnaderna ligger främst hos kolhydraterna. Ett exempel på ett lite avvikande EPO är rhEPO.
 

Rekombinant mänskligt EPO (rhEPO)

Forskarna inser tidigt att EPO motverkar blodbrist så man vill ta fram det i stora mängder men det är svårt eftersom det finns så lite EPO i blodet. Det måste alltså framställas på något annat sätt och det enda sättet att göra det är att klona genen för EPO. I slutet av 80-talet framställs ett läkemedel genom s k rekombinant genteknik, man har då fått rekombinant mänskligt EPO som är homogent med peptidsekvensen hos naturligt EPO. Enda skillnaden är kolhydratstrukturen. Atleter som bloddopar sig injicerar rhEPO och produktionen av röda blodkroppar ökar, vilket medför en ökad syresättning av musklerna.
 

Receptorn (EPOR)

            
Bild 2 och 3 visar EPO-receptorns extracellulära del och  Bild 2 (van der Waalâs radier) föreställer EPOR med inbunden EPO-liknande ligand i rött. Bild 3 visar receptorn och dess proteinstruktur.
 

EPO receptorn är ett transmembrant protein som består av 508 aminosyror och har en molekylvikt på 55 kDa. Den är en homodimer i sin aktiva form. Receptorn består av en transmembran del, en cytoplasmisk domän och en ligandbindande extracellulär subenhet (som förmodligen består av två domäner). I den externa delen av receptorn finns fyra konserverade cystiner, som bildar två disulfidbindningar, och ett s k WSXWS motiv. Dessa karaktärer har den gemensamt med vissa andra receptorer som tillhör samma superfamilj (tillväxthormon tillhör denna familj). Studier visar att WSXWS motivet spelar en stor roll i veckningen men har nog inte någonting att göra med bindandet av ligander. (se bild 2 och 3).

Dimerisering av EPOR leder till fosforylering av dess cytoplasmiska domän genom samverkan med ett kinas som heter Janus kinas 2. Detta startar en kaskad av signaler som leder till att röda blodkroppar bildas. När EPO kommer fram till receptorn bäddas den in i en djup klyfta mellan de två extracellulära domänerna och en hydrofob del bildas mellan receptorn och EPO. Polära interaktioner mellan dem på botten av klyftan leder sedan till dimerization av EPOR.
 

Effekter av EPO på idrottsmän i uthållighetssporter.

Ett experiment som utförts på Hormon Laboratoriet vid Aker Universitets Hospitalet i Oslo visar effekterna av tillsatt rhEPO hos idrottsmän. Detta experiment visar på ökade halter av hemoglobin (g/dl) hos de idrottsmän som tagit rhEPO. (se figur 2)
 
 


Figur 2. Grupp A har fått rhEPO tillsatt i 30 dagar medan grupp B inte fått något man kan tydligt se skillnaderna mellan grupperna. Man kan även se att effekten är fördröjd eftersom produktionen av nya blodkroppar tar ett par dagar.
 

Risker med EPO

rhEPO är ett mycket pålitlig läkemedel som nästan inte har några bieffekter. Men vid injicering av för stora mängder rhEPO utsätter man kroppen för stora risker. När man ökar antalet blodkroppar blir blodet mer trögflytande vilket kan leda till sämre cirkulation och ett högre blodtryck än normalt. Blodet hos de som injicerat rhEPO får ett högre värde av blodkroppar och även en högre blodplättsaktivitet vilket kan leda till att blodplättarna kladdar ihop sig. Detta medför en ökad risk för blodpropp som kan ge livslånga handikapp och i vissa fall leda till döden. Missbruk av rhEPO kan även leda till att kroppens styrning av naturligt EPO slås ut p g a för höga halter av injicerat rhEPO. Detta kan leda till blodbrist när rhEPOât lämnar blodbanan och kroppen inte hinner komma igång med den egna produktionen av naturligt EPO.
 

Metoder för att detektera dopning med EPO.

Det är som sagt skillnader på det naturliga EPO som kroppen producerar och rhEPO som injiceras, men skillnaden är så liten att det är svårt att bevisa att doping har genomförts. rhEPO och EPO har inga skillnader vad gäller aminosyra struktur utan olikheterna ligger i sockerkedjorna. Dessa skillnader finns på fyra platser i hormonet. Sockerkedjorna har effekt både på fysikaliska egenskaper och påverkar även dess kemiska beteende. Till exempel så finns skillnader i laddning på de olika EPO molekylerna. Detta kan utnyttjas för att detektera om det finns andra än kropps egna EPO molekyler i blodet. Till denna metod används kapillär elektrofores. Eftersom EPO bryts ner relativt snabbt kan det bara detekteras i två dagar efter injiceringen, men effekten sitter kvar i minst en vecka.
 

Hemohes

För att dölja "tung" detekterbar doping som t ex EPO har det blivit allt vanligare att man tar "lättare" doping t ex Hemohes. Hemohes är en vätskelösning bestående av stora sockermolekyler liknande glykogen. Hydroxyetyl stärkelsen har hög osmolaritet vilket gör att plasmavolymen i blodbanan ökar. Detta gör att blodkropparna späds ut och hematokritvärdet (procentandelen röda blodkroppar av totala mängden blodceller och plasma) sänks.

Hemohes och liknande preparat används inom sjukvården t ex vid brännskador då kapillärbädden skadats och plasman runnit ut. Eftersom blodkropparna i detta fall stannar kvar i blodbanan räcker det med att ge t ex Hemohes för att blodvätskan ska återställas. Hemohes kan användas som doping i två avseenden. Dels genom att enbart injicera Hemohes eller efter att EPO injicerats.
Genom att enbart injicera Hemohes tunnas blodet ut d v s hematokriten sänks och kroppen börjar producera EPO som i sin tur normaliserar hematokriten så att balansen av blodkroppar och blodplasma jämnas ut. Efter 7-10 dagar försvinner Hemoheset i form av blodplasma ur kroppen och därmed blir hematokriten högre än vad det var innan Hemoheset tagits och fler blodkroppar som kan transportera syre har bildats.

Genom att först ta EPO som ger ett högt hematokritvärde, vilket lätt kan detekteras av blodprov i dopingkontroller, har det blivit allt vanligare att elitidrottare i uthållighets-grenar tar Hemohes för att späda ut den höga halten av röda blodkroppar. Detta gör att EPOs effekter blir svårdetekterade eftersom hematokriten inte förändras trots antalet röda blodkroppar i blodet ökar kraftigt. En annan fördel med ökad blodvolym är att man kan träna mer och hårdare utan att bli dehydrerad.
Hemohes strukturen bryts ner av blodet och nya mindre kedjor bildas och transporteras till andra organ, utsöndras i urinen eller gallan. Spår av Hemohes kan detekteras i urinen med gas kromatrografi ö mass spektrometri (GC-MS) som är en mycket effektiv metod men p g a att det är en omfattande och tidskrävande metod används den inte vid dopingtester.
 

Referenser:

Internet:
http://www.rndsystems.com/asp/g_sitebuilder.asp?bodyId=197
http://www.coachr.org/epo.htm
http://www.iaaf.org/TheSport/Science/NSA15_1/Bibliography.html
http://www.medicallink.se/news/newsnr6044.html

Bilder:
PDB (Protein Data Bank), http://www.rcsb.org/pdb